Séance du mercredi 1 octobre 2014

FORUM DE RECHERCHE CHIRURGICALE 2014 - 4 SEANCES / 18 COMMUNICATIONS (du mercredi 1er octobre au vendredi 3 octobre) organisé par l’AFC et l’Académie Nationale de Chirurgie, dotation Brothier
07h30-10h00 - AFC, Palais des Congrès
Organisateur : Dominique FRANCO (Paris) / Présidence : Denis COLLET (AFC) et Daniel JAECK (ANC)

Résumé
Introduction et objectifs: Il a été récemment suggéré que la metformine (Glucophage®), en plus de son action antidiabétique, pouvait avoir une action antitumorale intrinsèque notamment sur le carcinome hépatocellulaire (CHC). Le syndrome métabolique (SM) dont l’incidence est en constante augmentation, est désormais reconnu comme un des principaux facteurs de risque d’hépatopathie chronique et de CHC, principalement par le développement de lésions de Non Alcoholic Fatty Liver Disease. Toutefois, l’état inflammatoire systémique généré par le SM via l’insulino-résistance, semble également contribuer à la promotion tumorale et apparaît comme une cible potentielle du traitement par metformine. Ainsi, le but de ce projet est d’évaluer les effets antitumoraux de la metformine d’une part via son action anticancéreuse intrinsèque, et d’autre part via son action première sur l’insulinorésistance et ses manifestations parenchymateuses hépatiques.
Méthodes : In vitro, l’action antitumorale de la metformine à différentes concentrations (1, 2.5, 5, 10, 20 mMol) a été testée sur trois lignées cellulaires d’hépatome humain (HepG2, Hep 3B et Huh7). In vivo, l’action antitumorale intrinsèque de la metformine a été analysée à différentes posologies, y compris antidiabétiques, sur des souris nude xénogréffées en sous cutanée. Par ailleurs l’action anticancéreuse potentielle de la metformine via son influence sur l’insulinorésistance et ses manifestations parenchymateuses hépatiques à été étudiée sur des souris nude soumises à des régimes différents (régime normal, régime riche en graisse favorisant l’insulino-résistance et régime riche en fructose favorisant la stéatose hépatique) secondairement xénogréffées en sous cutanée et en intra-hépatique. Les mécanismes de l’action antitumorale intrinsèque ont également été analysés sur des CHC humains de patients présentant un SM et recevant ou non de la metformine à visée antidiabétique en préopératoire. Enfin, une analyse immunohistochimique a été conduite afin de déterminer les effets de la metformine sur les tumeurs xénogréffées et humaines.
Résultats: In vitro, la metformine inhibait la viabilité des trois lignées cellulaires sans induire d’apoptose. In vivo, la croissance tumorale était significativement plus importante en contexte d’insulino-résistance alors que la stéatose hépatique ne semblait avoir qu’une influence limitée. Dans un tel contexte, la metformine, même à des posologies antidiabétiques, limitait cette croissance tumorale via un blocage du cycle cellulaire en phase G0/G1 et une inhibition de la voie de m-TOR mais sans réel effet sur la stéatose hépatique. Ces mécanismes d’action étaient confirmés sur CHC humains de patients présentant un SM. Enfin, l’analyse immunohistochimique sur tumeurs xénogréffées et humaines mettait en évidence des effets hypoxique et antiangiogénique de la metformine.
Conclusion : De par son action antitumorale intrinsèque et son action sur l’insulino-résistance, la metformine pourrait être une thérapeutique prometteuse dans le traitement du CHC sur syndrome métabolique.

Résumé
Contexte : Le traitement des cancers colorectaux (CCR) de stade avancé (envahissement ganglionnaire ou métastatique) repose sur la chirurgie et la chimiothérapie à base de 5-Fluorouracile (5-FU). Celle-ci se heurte à la chimiorésistance, un phénomène complexe qui inclut notamment la surexpression par la tumeur de molécules d’efflux de la famille ABC (ATP Binding Cassette). Cdx2 est un facteur de transcription spécifiquement exprimé dans les cellules épithéliales intestinales qui joue un rôle crucial dans leur différenciation. Il a notamment pour gènes cibles des molécules impliquées dans le phénotype intestinal telles que des molécules d’adhésion, des composants du mucus ou des enzymes intestinales. L’expression de Cdx2 dans les CCR est hétérogène : elle est réduite dans la majorité des CCR, mais est souvent augmentée dans les CCR hypermucipares. Ceci pourrait influer sur la chimiorésistance anticancéreuse car la molécule d’efflux ABCB1 a récemment été identifiée comme un de ses gènes cibles.
Objectifs : Les objectifs de ce travail sont de déterminer l’impact de Cdx2 sur la résistance à la chimiothérapie anticancéreuse dans les CCR et éventuellement d’identifier le mécanisme moléculaire impliqué dans cette résistance.
Méthodes et résultats : Nous avons observé avec des tests de survie MTT que les cellules cancéreuses coliques différenciées (lignée Caco2/TC7) et celles dans lesquelles la surexpression de Cdx2 a été induite (lignée HT29-TW6) sont plus résistantes au 5-FU que les cellules contrôles. Par RT-qPCR, nous avons constaté que l’expression de plusieurs transporteurs de la famille ABC (ABCB1 et ABCC11) est augmentée dans ces cellules. Des approches de gain de fonction (transfection de Cdx2) ou perte de fonction (transfection de siRNA) dans des cellules cancéreuses coliques HCT116 nous ont permis de montrer que Cdx2 est nécessaire à l’expression d’ABCC11, un transporteur qui permet l’efflux du 5-FU. Des expériences de gêne rapporteur luciférase et d’immunoprécipitation de chromatine ont confirmé que Cdx2 régule directement l’expression d’ABCC11 et interagit avec son promoteur. Enfin, l’inhibition d’ABCC11 par le MK-571 permet de restaurer la sensibilité initiale au 5-FU des cellules surexprimant Cdx2, suggérant ainsi que l’activité d’ABCC11 est nécessaire à la chimiorésistance induite par Cdx2.
Conclusion : Ces résultats montrent que Cdx2 pourrait contribuer à la chimiorésistance au 5-FU des CCR par l’intermédiaire du transporteur ABCC11, identifié comme un nouveau gène cible. Cette étude sera poursuivie par la recherche d’une corrélation entre la réponse à la chimiothérapie des patients et les niveaux d’expression de Cdx2 et d’ABCC11 détectés dans leur tumeur. À terme, ABCC11 pourrait représenter un nouvel outil pronostique ou une cible thérapeutique pour les CCR, en particulier pour les tumeurs hypermucipares surexprimant Cdx2.

Résumé
Rationnel : L’adénocarcinome pancréatique est la quatrième cause de mortalité par cancer dans le monde. Ce mauvais pronostic est attribué à une agressivité tumorale intrinsèque ainsi qu’une rapide chimiorésistance. Ce caractère chimiorésistant serait associé à la présence d’un sous-groupe de cellules présentant des caractéristiques de Transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). Notre objectif est d’étudier l’émergence d’un phénotype de TEM au sein de populations cellulaires pancréatiques chimiorésistantes mutées (BxPc-3) ou non (Panc-1) pour la voie du TGF ß et d’étudier les principales voies de signalisation impliquées.

Matériel et Méthodes : Les lignées tumorales pancréatiques BxPc-3 et Panc-1 ont été rendues chimiorésistantes après incubation à des concentrations croissantes de gemcitabine. L’étude de l’expression des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine) et mésenchymateux (Vimentine) ainsi que les facteurs de transcription directement impliqués dans la TEM (Snail, Slug, ZEB1 et ZEB2) a été réalisé par Western Blot et RTqPCR. L’étude de la migration a été réalisé par un test de blessure et l’invasion sur collagène de type I. Après l’identification des voies de signalisation impliquées par phosphokinase array et afin d’étudier leur rôle dans la TEM, des tests d’inhibition ont été réalisé utilisant des inhibiteurs pharmacologiques. Après 24h d’incubation, la chimiosensibilité par un test MTT et l’expression des marqueurs de TEM ont été quantifiés. Afin d’évaluer l’activation du promoteur de Snail, nous avons réalisé une mesure de l’activité luciférase en utilisant un système rapporteur. Une étude anathomopathologique des marqueurs de TEM a été réalisée sur 20 prélèvements en paraffine d’adénocarcinomes pancréatiques issus de tumeurs de patients réséqués traités ou non par chimiothérapie néoadjuvante.
Résultat : Nous avons observé une perte de l’expression des marqueurs épithéliaux et une majoration des marqueurs mésenchymateux dans les Panc-1 chimiorésistantes. L’expression de Snail, Slug, ZEB1 et ZEB2 était significativement plus élevée dans les clones chimiorésistants des Panc-1 sans activation du promoteur de Snail. Les cellules Panc-1 chimiorésistantes ont acquis des modifications morphologiques avec apparition de lamellipodes et augmentation de capacités d’invasion et de migration in vitro. Les cellules BxPc-3 chimiorésistantes bien que mutées pour la voie canonique du TGF ß, présentaient sous chimiothérapie l’apparition de lamellipodes et une redistribution de la vimentine dans le cytoplasme ainsi qu’une majoration des capacités d’invasion et de migration. Cette modification morphologique a été accompagnée d’une perte de l'expression membranaire de la E-cadhérine dans les BxPc-3 chimiorésistantes. En revanche, aucune modification de la Vimentine ni des facteurs de transcription n’a été observé.
Ces modifications phénotypiques et fonctionnelles ont été associées à l’activation de la voie des MAP kinases, mTor/AKT et Wnt/β-caténine. La Rapamycine, le U0126 et le LY294002 induisaient une baisse de l’invasion, la migration et la chimiorésistance. L’utilisation d’un siZEB1 induisait une une perte du phénotype TEM ainsi que le caractère chimiorésistant dans les Panc-1. Nous avons également observé une réexpression des marqueurs épithéliaux après l'arrêt de la chimiothérapie dans les Panc-1 (transition mésenchymato-épithéliale). Dans la série de patients, nous avons observé en périphérie des tumeurs, des cellules isolées surexprimant la vimentine avec une diminution de la E-cadhérine. Ces cellules ont été retrouvées plus fréquemment chez les patients traités par chimiothérapie néo adjuvante. Ce phénotype était associé à une médiane de survie sans récidive plus faible (6.5 vs 11.5 mois).

Conclusion : La chimiorésistance induite par la gemcitabine est associée à une modification du phénotype cellulaire avec apparition d’un phénotype agressif de type TEM en fonction du statut mutationnel des cellules.

Résumé
Le développement de stratégies personnalisées pour la prévention et la détection précoce des cancers, qui est le premier axe de recherche stratégique et innovant du plan cancer 2014-2019, pourrait permettre de diminuer la morbi-mortalité élevée des carcinomes épidermoïdes de la cavité orale en identifiant précocement les patients porteurs de lésions orales à haut risque de cancer. Notre objectif est de caractériser la dynamique des changements moléculaires au cours du temps dans les lésions à potentiel malin (LPM) de la cavité orale, afin d’identifier des évènements moléculaires clés dans leur processus de transformation maligne, qui pourraient être utiles dans la décision médico-chirurgicale comme biomarqueurs du risque de cancer plus performants que les seuls paramètres cliniques et histologiques.
Nous avons étudié la dynamique du transcriptome au cours du processus tumoral dans un modèle murin de carcinogénèse orale induit chimiquement par un agent carcinogène (4-NQO). Notre hypothèse est que les changements d’expression des gènes dans ce modèle nous permettront d’identifier les patients ayant une LPM associée à un risque élevé de cancer et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Au total, 52 souris ont été réparties en un groupe contrôle et un groupe traité par le 4-NQO administré dans leur boisson pendant 8 semaines. Toutes les 4 semaines, 4 souris étaient sacrifiées dans chaque groupe et leurs langues étaient excisées puis incisées longitudinalement. Chaque hémi-langue était ensuite incluse, congelée puis coupée au cryostat pour coloration. Les différents aspects épithéliaux de la tumorigenèse multi-étapes observés dans ce modèle (normal, hyperplasie, dysplasie et tumeur) étaient repérés en collaboration avec un anatomopathologiste (VetagroSup, Lyon) puis microdisséqués par système laser couplé à un microscope. Après extraction et amplification des ARNs, un triplica biologique pour chaque stade de transformation était analysé sur puce d’expression. Nous avons identifié une liste de ~1300 gènes différentiellement exprimés entre les échantillons murins tumoraux et normaux, que nous avons ensuite validés après sélection de leurs orthologues humains (~1000 gènes), dans 3 séries humaines indépendantes comparant des échantillons tumoraux et normaux de la cavité orale. Certains gènes comme S100A9 ou le récepteur tyrosine kinase MET sont des candidats intéressants comme biomarqueur de risque ou cible thérapeutique potentielle. L’analyse de la dynamique d’expression de ces gènes au cours de la transformation maligne a permis d’identifier 2 groupes principaux de gènes : le « early change gene set » (ECGS), incluant 318 (32%) gènes dont l’expression se modifiait très précocement dès le stade d’hyperplasie et le « progressive change gene set » (PCGS) incluant 520 (53%) gènes dont l’expression se modifiait plus progressivement au cours du processus tumoral. Seul le PCGS était significativement associé au risque de développer un cancer chez 86 patients suivis prospectivement au MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) pour une LPM, et pour lesquels nous disposions des données d’expression des biopsies de leur LPM. Ces résultats sont cohérents avec une étude que nous avons menée en parallèle dans la même cohorte de patients mais à un autre niveau d’altération moléculaire, et dans laquelle nous avons montré que la persistance des pertes d’hétérozygotie détectées sur des biopsies successives était plus significativement associée au risque de développer un cancer que leur seule détection à un temps donné.
Ces données, issues d’une collaboration internationale et multidisciplinaire, soulignent la pertinence du modèle murin utilisé et l’importance de l’étude de la dynamique des changements moléculaires au cours du temps plutôt qu’à un moment donné de l’évolution. Nous espérons pouvoir ainsi personnaliser la prise en charge médico-chirurgicale des patients à risque de cancer de la cavité orale.

Résumé
Introduction- L'arthroplastie totale de hanche est actuellement l'intervention la plus souvent pratiquée chez les patients atteints d’ostéonécrose de la tête fémorale (ONTF). Le taux de survie des prothèses articulaires ne permet pas de se satisfaire de cette solution pour ces patients, le plus souvent jeunes. Parmi les chirurgies conservatrices proposées, le forage associé à l’injection de moelle osseuse concentrée (MOC) autologue constitue le traitement de référence. Son efficacité sur l'évolution de l’ONTF est dépendante de facteurs liés aux caractéristiques du greffon (nombre et concentration en progéniteurs ostéoblastiques) et de l’hôte (potentiel de revascularisation du site de forage et capacité de régénération du tissu osseux). La thérapie cellulaire et l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (MSC) dans cette indication suscite de nombreux espoirs car elle pourrait permettre d’augmenter l’efficacité de la greffe (amplification +/- différenciation ostéoblastique), tout en réduisant la morbidité opératoire (possibilité de prélever des MSC sous anesthésie locale). L’objectif de cette étude préclinique était de vérifier que l'injection de MSC permettait d'obtenir une ostéoformation satisfaisante, puis de comparer ce pouvoir ostéogénique à celui de la moelle osseuse concentrée.
Matériels et méthodes- Un modèle expérimental d’ostéonécrose post-chirurgicale par dévascularisation de la tête fémorale a été développé chez le rat immunodéficient NUDE. La moelle osseuse humaine était obtenue par ponction trans-osseuse percutanée à partir de donneurs vivants. La concentration était réalisée par séparation sur gradient de densité (technique du Buffy-coat), au sein de l’Etablissement Français du Sang des Pays de la Loire. Les MSC humaines étaient obtenues à partir de la moelle osseuse des mêmes donneurs, par culture et amplification. La MOC ou les MSC étaient implantées par forage trans-cervical dans la tête fémorale un mois après l’induction de l’ostéonécrose. Chaque rat constituait son propre contrôle après forage seul de la hanche contro-latérale. Une implantation de MOC ou de MSC était réalisée en parallèle dans le tissu sous-cutané dans le but d’étudier son pouvoir ostéogénique en site ectopique. Un mois après l’injection, les rats étaient euthanasiés afin de réaliser une analyse histomorphométrique quantitative permettant d’évaluer la vitalité du tissu osseux par la mesure d’un indice de cellularité du tissu osseux.
Résultats- Après injection de MOC, nous avons mis en évidence une augmentation de l’indice moyen de cellularité (significative pour l’os trabéculaire et non significative pour l’os spongieux), par rapport au forage seul. Après injection de MSC, nous avons également mis en évidence une augmentation de l’indice moyen de cellularité par rapport au forage seul (non significative pour l’os trabéculaire et très significative pour l’os spongieux). Les implantations sous-cutanées de MOC ou de MSC n’ont pas permis d’obtenir la formation d’os en site ectopique. L’étude de la biodistribution des cellules injectées confirme leur présence dans la tête fémorale le jour de l’injection, puis leur disparition un mois après l’injection.
Conclusion- Nos résultats confirment que l’injection de MSC et de MOC est responsable d’une augmentation de la cellularité des têtes fémorales. Cette amélioration semble plus importante après injection de MOC. L’étude de la vascularisation des têtes fémorales montre également des résultats meilleurs après injection de MOC. La purification des MSC, responsable de l’élimination des progéniteurs hématologiques et endothéliaux, pourrait expliquer ces résultats. Le pouvoir ostéogénique des greffons cellulaires semble ainsi principalement lié à un mécanisme paracrine. Nous poursuivons actuellement l’étude de ces mécanismes dans le but d’optimiser l’efficacité de la thérapie cellulaire dans l’ONTF.

Résumé
Objectif : La laryngectomie totale, pratiquée dans les cas de carcinomes pharyngo-laryngés étendus, induit une mutilation majeure avec d’importantes séquelles physiques et psychologiques par l’abouchement définitif de la trachée à la peau. À ce jour, seules des techniques de réhabilitation vocale sont disponibles pour améliorer la qualité de vie des patients. Grâce à un partenariat industriel et après plusieurs années d’études menées in vitro et in vivo, notre équipe a développé un larynx artificiel sans nécessiter de recours à un traitement immunosuppresseur.
Matériels et Méthodes : Le larynx artificiel est composé de 2 structures : 1) une structure rigide inamovible biointégrable composée de titane poreux destinée à prolonger la trachée restante après laryngectomie totale ; 2) une double valve remplissant la triple fonction de respiration, déglutition, phonation. La prothèse inamovible est composée d’un assemblage de microbilles de titane avec une porosité de 25% autorisant une colonisation cellulaire de l’implant. L’intégration de la prothèse inamovible en remplacement d’un segment trachéal a été testée in vitro et in vivo sur les modèles animaux rats, lapins et brebis. Nos travaux nous ont mené à expérimenter : 1) différents protocoles opératoires d’implantation de la prothèse de trachée; 2) une modification de la composition et de la structure de la prothèse par ajout d’une structure polymérique microporeuse et biodégradable à base de PLA (poly(acide lactique)); 3) l'effet de la variation de la structure macroporeuse, par changement de la taille des billes de titane composant la prothèse. Suite à l’ensemble de ces résultats, nous avons réalisé la première application clinique du larynx artificiel.
Résultats : 3 résultats majeurs découlent de nos travaux : 1) la tolérance de la prothèse de trachée en terme de survie chez le gros animal est améliorée lorsque l’on modifie le protocole opératoire par ajout d’un tube de silicone endoprothétique; 2) l’intégration tissulaire de la prothèse de trachée hybride constituée de titane poreux et de matériel polymérique biodégradable est supérieure à celle des prothèses en titane poreux nu; 3) la vitesse de colonisation des prothèses en titane poreux est accélérée lorsque l’on diminue la taille des billes. Sur le plan clinique, 2 premiers patients ayant subi l’ablation du larynx pour raison carcinologique ont été implantés avec une prothèse de larynx artificiel fonctionnelle en 2 étapes chirurgicales : 1) mise en place de la prothèse inamovible; 2) mise en place de la double valve par voie endoscopique dans un deuxième temps. La tolérance au matériel s’est révélée très bonne. Le rétablissement d’un néo-pharyngolarynx entre les voies respiratoires et digestives a permis aux patients de respirer par la cavité buccale, de s’exprimer avec une voix chuchotée et de déglutir la salive tout en maintenant l’orifice de trachéotomie fermé par intermittence.
Conclusion : Nos études d’intégration de prothèses de trachées in vitro et in vivo ont permis de contribuer à la mise en place chez l’homme d’un larynx artificiel après laryngectomie totale (cancer du larynx). Cette implantation, première mondiale réalisée en 2012, laisse entrevoir, depuis la première laryngectomie réalisée en 1873, un véritable espoir de réhabilitation pour les patients devant subir cette mutilation. Il s’agit d’une preuve de concept qui nécessite un perfectionnement.
Perspectives : Deux stratégies d’amélioration sont en cours d’étude: 1) traitement de surface visant à améliorer l’intégration tissulaire; 2) amélioration du système de valves concentriques visant à limiter au maximum le risque de fausse route. Notre équipe participe également à 2 projets européens i.e., le projet BiMOT avec pour objectif le monitoring en continu de l’intégration tissulaire des implants et le projet IMMODGEL visant à contrôler l’inflammation autour des prothèses par modification du phénotype macrophagique.

Résumé
Introduction/Analyse du besoin : Le traitement actuel des Dissections aortiques de type B (Fig 1A) consiste à déployer un stent couvert (ou endoprothèse) en regard de la porte d’entrée proximale de dissection
(située dans 90% des cas au pied de l’artère sous clavière gauche), afin de fermer cette porte d’entrée et de réorienter le flux sanguin aortique dans le vrai chenal (Fig. 1B). Ce traitement endovasculaire a permis de diminuer la mortalité opératoire chez ces patients par rapport à la chirurgie conventionnelle (32.1% vs 6.5%) mais est loin d’être optimal car associé à un taux élevé de réintervention, jusqu’à 46% selon les séries. En effet, si l’endoprothèse permet de traité la portion proximale de l’aorte disséquée (en raison de son caractère couvert (Fig. 2) elle ne peut pas être déployée de manière extensive car cela entrainerait la perte des collatérales aortiques), la portion distale va fréquemment connaître une évolution anévrysmale en raison de la présence de portes de réentrées de dissection.
Le but de notre étude était d’évaluer expérimentalement une technique innovante consistant à déployer un stent non couvert (Fig. 3) dans le vrai chenal d’une aorte disséquée et sur toute la hauteur de la dissection pour permettre une guérison aortique complète tout en préservant la collatéralité aortique du fait du maillage large du stent.
Dans ce but, nous avons préalablement mis au point un modèle de DAB dont le diamètre aortique permettait l’utilisation de ce stent conçu pour aorte humaine, et dont l’extension de la dissection permettait l’évaluation de la perméabilité des artères collatérales aortique au plus proche des conditions cliniques. Aucun modèle rapporté dans la littérature ne présentait ces caractéristiques

Matériel et méthode : Quinze aortes humaines ont été prélevées sur cadavre frais. La dissection était initiée chirurgicalement 2cm en aval de l’artère sous clavière gauche. Les aortes étaient ensuite connectées à une pompe produisant un flux pulsatile afin de propager la dissection. Un optique de 5-mm 30° (Richard Wolf, Vernon Hills, III) était introduit alternativement dans le vrai et le faux chenal pour monitorer la propagation de la dissection. Les stents nus étaient déployés dans le vrai chenal depuis la porte d’entrée proximale jusqu’à l’aorte sous rénale. La pression systolique était mesurée dans le tronc coeliaque, l’artère mésentérique supérieure et les artères rénales avant et après déploiement du stent nu. Une chute de la pression systolique de plus de 15 mmHg après déploiement du stent était considérée comme significative.

Résultats : Le diamètre moyen aortique était de 26.5+/-2.9 mm. La dissection s’est propagée jusqu’aux artères rénale dans 11 cas (73%), et jusqu’à l’aorte sous rénale dans 3 cas (20%) (Fig. 4 et 5). Sur les 60 artères viscérales étudiées, 22 (36.7%) naissaient du faux chenal. Après déploiement extensif du stent nu, dans tous les cas un ré-accolement complet du flap de dissection a été observé (Fig. 6). Concernant la perméabilité des artères digestives et rénales après déploiement du stent, une chute significative de la pression a été observée dans 54.5% (n=12) lorsque celle-ci étaient perfusées par le faux chenal, et dans 7.9% des cas (n=3) lorsqu’elles naissaient du vrai chenal (Fig. 7). Cependant, ces artères collatérales sténosées ont pu être cathétérisées à travers les mailles du stent dans 20 cas sur 23, avec donc possibilité de stenting pour lever la sténose.

Conclusion/perspectives cliniques : Ce travail a permis la réalisation du 1er modèle de dissection aortique de type B sur aorte humaine, seul modèle dans la littérature rapportant exactement les caractéristiques anatomiques et dynamiques des dissections aortiques de type B rencontrées en pratique clinique.
Nous avons pu évaluer de manière expérimentale une technique novatrice pour le traitement des patients atteints de cette pathologie : le traitement extensif de l’aorte thoraco-abdominale avec mise en place d’un stent nu à maillage large. Ce nouveau concept permet une guérison complète de la dissection dans tous les cas. Il est associé à un risque non négligeable de sténose des artères viscérales mais cependant ces artères pouvaient être reperméabilisées à travers les mailles du stent. Ce nouveau concept, couplé avec des procédures accessoires de stenting des artères collatérales en cas de nécessité, permet une guérison extensive de l’aorte au stade aigu de la dissection et donc de prévenir l’évolution anévrysmale distale des aortes disséquées, limitant ainsi le risque de rupture ou de réintervention chez ces patients.

Résumé
Introduction : Cette étude porte sur la comparaison de trois polymères biorésorbables, un polyuréthane (PU), un polyhydroxyalkanoate (PHA) et le polydioxanone (PDO) et de deux techniques de biofonctionnalisation, par cellules stromales du tissu adipeux (ADSC) ou un motif peptidique, le RGD.
Objectif : Le but à terme est de recréer, grâce à la sélection du matériau et de la technique de biofonctionnalisation, un tube valvé doué d’un potentiel de croissance utilisable dans une population pédiatrique.
Matériels et Méthodes : La partie in vitro du travail a porté sur le comportement des ADSC en termes de prolifération et de survie au contact du PU, du PHA et du PDO par la réalisation d’un test de viabilité au MTT et l’analyse par cytométrie en flux du Ki67 et de l’Annexine 5, marqueurs de prolifération et d’apoptose. La partie in vivo a consisté, chez 53 rats Wistar en un remplacement partiel de la veine cave inférieure (VCI) avec des patchs électrospinnés de PU (n=21), PDO (n=18) ou PHA (n=14) tandis que 31 rats nude ont été implantés avec des patchs de PDO biofonctionnalisés avec des ADSC allogéniques (n=17) ou le motif du RGD (n=14). Les résultats à 6 semaines et 3 mois ont été analysés par imagerie par résonance magnétique (IRM), histologie et immunohistochimie, à la recherche de cellules endothéliales, cellules musculaires lisses, macrophages M1 et M2 (facteur Von Willebrand, actine musculaire lisse, ED1 et ED2 respectivement). Des dosages d’IL-6, IL-10, iNOS et de MCP-1 ont également été réalisés par ELISA.
Résultats : Le PDO est le biopolymère présentant les meilleures propriétés en termes de viabilité et de prolifération cellulaire. L’IRM n’a montré de thrombose, de sténose ou de dilatation au niveau des zones d’implantation pour aucun des patchs. Les trois polymères sont comparables en termes d’endothélialisation, mais seuls le PDO et le PHA ont présenté une couche continue de cellules musculaires lisses. Les patchs de PU ont entrainé une importante réaction inflammatoire granulomateuse. Aucune différence significative n’a été démontrée entre les deux techniques de biofonctionnalisation.
Conclusion : Ces données confirment la bonne biocompatibilité du PDO et soutiennent le concept que la biofonctionnalisation de polymères par des motifs peptidiques peut se substituer à l’utilisation des cellules souches.

Résumé
La diffusion des techniques endovasculaires a permis d’élargir les indications opératoires aux patients les plus fragiles, souvent considérés inopérables, en réduisant le taux de morbi-mortalité. Une des limites restantes est représentée par la navigation dans les 3 dimensions de l’espace sous contrôle scopique bidimensionnel chez les patients avec une anatomie compliquée. Le contrôle manuel des guides devient impossible, augmentant la durée des interventions, l’exposition aux radiations ionisantes et l’injection de produit de contraste.
Actuellement le système le plus utilisé est le Sensei (Hansen Medical, USA) qui manque par contre d’un retour de force. Secondairement, en raison du prix très élevé il est peu accessible.
Le but de notre étude est la réalisation d’un système d’assistance à la navigation entièrement robotisé. Le chirurgien aura toujours la possibilité de reprendre manuellement le contrôle de la navigation à l’aide d’un dispositif haptique.
Les enjeux techniques et scientifiques consistent à :
- planifier la trajectoire en 3D depuis le point d’entrée jusqu’à la destination finale,
- mettre en place des actionneurs permettant de déplacer le guide,
- concevoir et piloter une interface haptique permettant au chirurgien d’avoir un ressenti au plus proche de la réalité,
- développer des modèles numériques capables de prendre en compte l’interaction entre les outils semi-rigides et les vaisseaux plus ou moins pathologiques.
Une étude préliminaire a déjà été réalisée aboutissant à un premier prototype fonctionnel. Ce dernier permet de reproduire les gestes chirurgicaux et permet de déplacer un guide standard dans un modèle semi-rigide de l’arbre vasculaire. Le contrôle se fait par le biais d’un joystick et la visualisation est directe.
Parallèlement, nous avons élaboré, à partir de la déformation des vaisseaux pathologiques pendant les procédures de routine, un modèle numérique capable de calculer la résistance de la paroi artérielle aux sollicitations mécaniques. Le système haptique sera donc paramétré afin que le manipulateur puisse ressentir la résistance de la paroi vasculaire.
La trajectoire à suivre sera déterminée par un modèle numérique du réseau vasculaire du patient à partir du scanner pré opératoire.
Nous pensons que l’étroite collaboration entre chirurgiens et ingénieurs pourra développer un système capable de standardiser des procédures complexes, afin d’améliorer les résultats d’une discipline encore en évolution.

Résumé
Introduction : Le court-circuit gastrique ou Roux-en-Y Gastric Bypass (RYGB) permet, en outre un amaigrissement prolongé, mais également une amélioration spectaculaire de l’équilibre glycémique, pour des raisons qui ne sont pas encore totalement élucidées. Des études expérimentales sur le grand mammifère sont nécessaires afin d’explorer les mécanismes impliqués dans l’amélioration de l’homéostasie glucidique après RYGB. Dans cette étude, nous avons exploré chez le Porc, le rôle respectif des anses intestinales du RYGB (anse alimentaire, anse commune, et anse biliaire) dans l'absorption du glucose, la sécrétion d'insuline et de GLP-1 (CEEA 152012).

Méthodes : Un RYGB imitant la procédure clinique avec une poche gastrique de 30 cc et une anse alimentaire en Roux a été réalisé chez 10 miniporcs de type Göttingen. Afin d’évaluer le rôle respectif de l’anse alimentaire et de l’anse commune, une test de clampage de l’anse alimentaire a été effectué par laparotomie sous anesthésie générale un mois après le RYGB (n=6) (Figure 1). La glycémie, l'insulinémie et de GLP-1 ont été mesurés sur des échantillons de sang prélevés au cours d’un repas test standardisé (RT) avant et après déclampage de l’anse alimentaire. Afin d’analyser le rôle de l’exclusion de la bile après RYGB, l’anse alimentaire a été exclue du reste du montage chirurgical par deux clamps (n=4). Un bolus glucose (75 g) a été injecté entre ces deux clamps suivi d’une injection de bile (20 cc).

Résultats : Au cours du test de clampage de l’anse alimentaire, les concentrations sanguines de glucose, d’insuline et de GLP-1 n’augmentent pas lors du passage du RT dans l’anse alimentaire. Après le déclampage, lorsque le RT progresse dans l’anse commune, la glycémie s’élève de façon significative suivie par une augmentation rapide des concentrations d’insuline et de GLP-1 (Figure 1). L’injection de bile dans l’anse alimentaire permet de restaurer l’absorption du glucose dans ce segment intestinal.
Conclusion : Après RYGB, le glucose n’est plus absorbé dans l’anse alimentaire en raison de l’exclusion biliaire. L’anse commune joue donc un rôle majeur dans les mécanismes d’absorption du glucose, de sécrétion d'insuline et de GLP- 1.

Résumé
Introduction : Afin d’avancer dans la compréhension de pathologies humaines comme les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), les modèles animaux bien caractérisés sont indispensables. La présence du gène HLA-B27 est fortement associée aux spondylarthropathies mais aussi à l’inflammation digestive. Le rat transgénique HLA-B27 (HLA-B27) développe spontanément une arthrite et une colite et constitue ainsi un modèle animal intéressant dans l’étude de ces maladies. Ce modèle est assez mal caractérisé notamment concernant la cinétique d’apparition, l’étendue et la sévérité de l’inflammation digestive.

Objectif du travail : L’objectif de notre travail est de caractériser l’inflammation digestive chez le rat HLA-B27 avec un suivi à 40 semaines à l’aide de différentes méthodes d’analyses : macroscopique, microscopique, biologie moléculaire et imagerie fonctionnelle.

Exposé des méthodes : Des rats transgéniques (Tg) HLA-B27 et des rats non transgéniques contrôle (nTg) de la même souche (F344) ont été inclus dans notre étude. Nous avons réalisé une étude prospective longitudinale avec recueil de critères macroscopiques tous les 10 jours (poids, alopécie, uvéite, diarrhée, boiterie). Des sacrifices ont été réalisés aux semaines 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 30, 35 et 40 avec recueil de l’état macroscopique de l’estomac, duodénum, intestin grêle, caecum et côlon. A chaque sacrifice, nous avons réalisé des prélèvements au niveau du duodénum, iléon distal et côlon pour analyses microscopiques (coupe histologique et coloration au May- Grunwald-Giemsa), et dosage des cytokines inflammatoires : TNF, IL17a, IL2, IL23, IL1, IL10, IL6, et IFN. Un suivi prospectif a également été réalisé par micro-TEP-TDM centré sur l’abdomen à différentes semaines de vie.

Résultats : 80 rats ont été inclus dans notre étude, 40 Tg et 40 nTg. Chaque sacrifice comportait 3 rats Tg et 3 nTg. Huit rats (4 Tg et 4 nTg) ont été suivis par micro-TEP-TDM.
Nous avons constaté une colite macroscopique avec augmentation de la vascularisation et épaisseur colique chez tous les rats Tg dès l’âge de 12 semaines par rapport aux rats nTg. Il n’existait pas d’éléments macroscopiques objectifs en faveur de gastrite, duodénite ou d’iléite chez tous les rats.
Les signes histologiques de colite étaient plus précoces et apparaissaient dès l’âge de 6 semaines chez les rats Tg. Il n’existait pas de signe histologique de gastrite, duodénite ou d’iléite à cet âge.
La colite présente chez les rats Tg était associée à une induction des cytokines inflammatoires : TNF, IL17a, IL2, IL23, et IL1 qui étaient respectivement 4,0 ; 16,6 ; 3,6 ; 1,4 ; et 2,5 fois plus exprimées au niveau du colon des rats Tg par rapport aux rats nTg à partir de 8 semaines. Ce rapport continuait à augmenter progressivement par la suite uniquement pour le TNF jusqu’à 30 semaines de vie pour ensuite atteindre un plateau.
L’imagerie par micro-TEP-TDM au 18-FDG révélait une hyperfixation au niveau du côlon et de l’iléon distal chez les rats Tg par rapport au rat nTg et ce tout au long du suivi. L’hyperfixation au niveau colique était deux fois plus importante qu’au niveau de l’iléon distal.

Conclusion : Notre étude caractérise, pour la première fois, de manière longitudinale l’inflammation intestinale chez le rat HLA-B27 à l’aide de différentes méthodes complémentaires. Nos analyses macroscopiques, microscopiques, de biologie moléculaire et par imagerie fonctionnelle objectivent et quantifient cette inflammation qui est induite spontanément au niveau du colon et peu ou pas retrouvée sur le reste du tube digestif. Cette étude suggère que le rat HLA-B27 est un bon modèle d’étude des MICI et peut servir de base pour développer des études originales pour mieux comprendre la physiopathologie des MICI et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Résumé
Introduction : Le descellement aseptique est la principale complication à long terme des arthroplasties totales de hanche. Il est défini par la perte de fixation des implants secondaire à une ostéolyse péri-prothétique (OPP). Le macrophage joue un rôle central dans le processus d’OPP. En réponse aux débris d’usures, les macrophages produisent de grandes quantités de dérivés oxygénés et nitriques hyperactifs (reactive oxygen species ROS/reactive nitrogen species RNS) qui amplifient la réaction inflammatoire locale et induisent une résorption osseuse qui aboutit à l’OPP. La sonde luminescente L-012 est une molécule dérivée du Luminol utilisée récemment comme un détecteur de dérivés ROS/RNS libérés aux cours des processus inflammatoires. Du fait de la grande spécificité de la sonde L-012 à reconnaitre les dérivés ROS/RNS, nous avons formulé l’hypothèse selon laquelle la visualisation in vivo de la réponse inflammatoire aux particules de PE pourrait se faire par bioluminescence.

Objectif : L’objectif de ce travail était de valider un moyen d’imagerie non invasif pour visualiser en temps réel la réaction inflammatoire induite par les particules de polyéthylène (PE).
Méthodes Le modèle d'ostéolyse de calvaria murin a été utilisé. Sous conditions d'asepsie stricte, 10 mg de PE ont été implantés au contact du crâne de souris mâles âgés de 8 semaines de type C57BL6. Un groupe contrôle (sham) a également été opéré, mais sans mise en place de particules. Au total, 64 souris ont été incluses. Après injection sous-cutanée de L-012, la bioluminescence était détectée in vivo et quantifiée à l’aide d’une caméra CCD à J3 J7 J14 et J21. Un sacrifice séquentielle aux mêmes délais (n=8 souris à chaque délai) était réalisé avec évaluation de l’ostéolyse par microscanner et analyse histomorphométrique. Une quantification par RT-PCR des ARNm des cytokines proinflammatoires (TNF alpha et IL1-b) a été réalisée après broyage des crânes. Des tests statistiques non paramétriques ont été utilisés.

Résultats : Après implantation de PE, on relevait une augmentation significative du signal luminescent émis dès J3 (p=0.001) avec un maximum atteint à J7 (p=0.001). Ensuite ce signal diminuait progressivement pour se normaliser à partir de J21. Dans le groupe sham, aucune modification du signal luminescent n'a été observée. L'analyse microscanner a mis en évidence une perte osseuse significative à J7 (p =0.01) et J14 (p=0.01), avec réparation osseuse à J21. Le signal luminescent était fortement corrélé aux taux et à la cinétique des ARNm des cytokines proinflammatoires r=0.98 (p<0.0001) pour le TNF-alpha et r=0.96 (p<0.0001) pour l’IL-1b.
Conclusion L’imagerie en bioluminescence par la sonde L-012 permet une visualisation en temps réel de l’inflammation induite par les débris d’usure. Ces résultats indiquent que la bioluminescence pourrait représenter un outil simple et non invasif d'évaluation de l’ostéolyse aux particules d’usures sur modèles animaux. Cet outil d’imagerie pourrait également évaluer l’efficacité de différentes approches thérapeutiques ou prophylactiques visant à limiter la réaction inflammatoire et l’ostéolyse sans sacrifice d’animaux.

Résumé
Introduction : Le glioblastome est une tumeur cérébrale de haut grade. Malgré les standards de traitement par exérèse chirurgicale suivi d’une radio-chimiothérapie concomitante, la médiane de survie reste limitée à 15 mois. La récidive est dans plus de 85% locale. La thérapie photodynamique trouve sa place dans l’amélioration du contrôle locale de la maladie.

Objectif : Déterminer l’efficacité accrue de l’illumination fractionnée et établir une corrélation radio-histologique en utilisant pour la première fois les séquences de diffusion et perfusion.

Méthodes : Il s’agissait d’une étude pré clinique utilisant des rats «nude » chez qui ont été greffés des cellules de lignée humaine de glioblastome U87 en condition stéréotaxique au sein du putamen droit. Une ancre crânienne a été laissée en place en fin de procédure. La croissance tumorale était monitorée en IRM 7 Tesla avec réalisation de séquences de diffusion et perfusion pour chaque animal. Pour le traitement, 4h après l’administration d’un photosensibilisant (5-ALA), une fibre optique à tir direct a été introduite via l’ancre. Son placement au tiers supérieur de la tumeur était contrôlé par imagerie. Les rats ont été randomisés en 3 groupes, l’un sans illumination, l’autre avec une illumination de 25J/cm2 à 30mW/cm2 avec une pause de 150 secondes après 20% de l’énergie délivrée et le dernier avec une illumination de 25J/cm2 à 30 mW/cm2 avec une pause de 150 secondes après chaque fraction de 5J/cm2. Les rats ont bénéficié en post traitement d’une corticothérapie à la dose d’1mg/Kg. L’effet du traitement était évalué par IRM à 72H, avec en particulier des séquences de diffusion et perfusion. Après réalisation de l’IRM, le rat était sacrifié pour étude histologique du tissu cérébral afin de quantifier la nécrose.

Résultats : 45 rats ont bénéficié d’une greffe de cellules U87. Le taux de prise de greffe a été > 85%. En IRM, nous avons observé une nécrose centrotumorale plus importante parmi les rats du groupe mutlfractionné associée à une inflammation péri lésionnelle plus marquée en comparaison avec les rats du groupe mono fractionné. Sur les séquences de diffusion, le coefficient moyen centro lésionnel était augmenté après traitement, d’autant plus dans le groupe multifractionné. Quant à la perfusion, celle-ci apparaissait diminuée en regard du site de traitement, et de manière plus marquée dans le groupe multifractionné. Après examen histologique, nous avons confirmé nos observations remnographiques avec une nécrose plus extensive et une raréfaction de la trame angiogénique après administration du traitement multifractionné. Aucun traitement n’a induit de décès prématuré.

Conclusion : La thérapie photodynamique interstitielle a induit une nécrose tumorale avec un effet antiangiogénique. Le traitement multifractionné a présenté un effet accru en termes de destruction du tissu tumoral et un effet antiangiogénique majorée en comparaison avec le traitement monofractionné. Les données IRM de diffusion et perfusion ont permis de prédire les lésions histologiques induites par la thérapie photodynamique.

Résumé
Introduction: L'évolution d'une cellule humaine vers une cellule tumorale est dépendante de l'acquisition successive d'anomalies leur conférant un avantage de croissance et leur permettant une expansion clonale. Parmi ces anomalies, la capacité d'échapper à la surveillance continue du système immunitaire s'est révélée être indispensable. Pour y aboutir les cellules tumorales ont développé différents mécanismes parmi lesquels l'instauration d'un microenvironnement immunosuppresseur favorisant l'accumulation de cellules immunorégulatrices, telles que les lymphocytes T régulateurs (Treg), et les cellules myeloïdes suppressives (MDSC), ainsi que l'inhibition des fonctions des lymphocytes T CD8+ effecteurs. Cette perte de fonction, appelée "exhaustion ou épuisement", passe notamment par l'expression à leur surface de molécules de co-stimulation inhibitrices telles que PD-1, Tim3, CTLA4 et LAG3. Au sein de ce microenvironnement tumoral, le vascular endothelial growth factor (VEGF)-A a longtemps été étudié pour ses propriétés pro-angiogéniques, aboutissant au développement de traitements anti-angiogéniques. Cependant, le VEGF-A possède également des propriétés immunomodulatrices favorisant l'échappement des cellules tumorales à la surveillance par le système immunitaire (induction de Treg et MDSC). Mais l'action du VEGF-A sur les lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur, n'est pas connue. Nous avons donc évalué l'implication potentielle de la voie VEGF-A/VEGFR dans l'épuisement des lymphocytes T intratumoraux, en analysant l'expression de molécules de co-stimulation inhibitrices à la surface de ces lymphocytes.

Matériels et Méthodes: In vitro des lymphocytes T CD8+ triés à partir de rate de souris naïves puis activés par de l'anti-CD3, ont été stimulés en présence ou non de VEGF-A. L'expression des molécules de costimulation inhibitrices (PD-1, Tim3, CTLA4, Lag3) a ensuite été analysée. In vivo, des souris porteuses de tumeurs colorectales (CT26) implantées en sous-cutané ou en intra-hépatique ont été traitées par différentes molécules anti-angiogéniques ciblant ou non la voie VEGFA/VEGFR (sunitinib, anti-VEGF-A murin et masitinib). Après traitement, l'expression des mêmes molécules inhibitrices a été étudiée par cytométrie en flux.

Résultats : Après 14 jours de traitements, seules les molécules anti-angiogéniques inhibant la voie VEGF-A/VEGFR (sunitinib et anti-VEGF-A murin) diminuent l'expression de PD-1 à la surface des lymphocytes T CD8+ intratumoraux. L'observation de l'expression des VEGFR sur les lymphocytes T CD8 activés infiltrant la tumeur suggère une action directe du VEGF-A sur les lymphocytes T. In vitro la stimulation des lymphocytes T CD8+ activés par du VEGF-A induit une augmentation de l'expression de PD-1 mais aussi d'autres molécules inhibitrices (Tim3, CTLA4 et LAG3) à la surface de ces lymphocytes T montrant un effet direct du VEGF-A sur l'épuisement des lymphocytes T. In vivo, cet effet est confirmé par la diminution de l'expression de PD-1 mais aussi de Tim3 et de LAG3 à la surface des lymphocytes T infiltrant la tumeur de souris traitées par anti-VEGF-A. De plus, l'association d'un anti-VEGF-A à un anticorps monoclonal anti-PD-1 permet d'obtenir un effet thérapeutique synergique, inhibant la croissance tumorale par apport à un traitement par anti VEGF-A ou anti-PD-1 seul.

Conclusion : Cette étude révèle, pour la première fois à notre connaissance, l'effet direct du VEGF-A produit par la tumeur sur l'expressio des molécules de costimulation inhibitrices à la surface des lymphocytes T CD8+ intratumoraux, suggérant un rôle clé du VEGF-A dans l'épuisement de ces lymphocytes. A la lumière de ces résultats, de nouvelles combinaisons thérapeutiques associant antiangiogéniques et immunothérapie pourraient être envisagées.

Résumé
Introduction. Le traitement curatif des tumeurs solides repose sur l'exérèse chirurgicale en marges saines (résection R0) associée ou non à des traitements systémiques. Dans certains cas, cette exérèse est impossible, laissant en place un résidu tumoral microscopique (R1) ou macroscopique (R2). Le caractère incomplet de la résection est un facteur majeur de mauvais pronostic, notamment dans le cancer colorectal. L'objectif de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la tolérance d'une injection intra-tumorale de chimiothérapie en hypotonie dans un modèle murin de résection chirurgicale incomplète de tumeur solide.

Matériel et méthodes. La partie in vitro a pour but de sélectionner la chimiothérapie (cisplatine, oxaliplatine, gemcitabine) et le milieu (milieu cellulaire complet, sérum physiologique, G5%, G2,5%) adaptés à la diffusion intra-tumorale. Après modélisation d'une tumeur colique implantée en sous-cutané à des souris nude, une résection R2 de la tumeur a été réalisée, suivie d’un traitement intra-tumoral. L'efficacité du traitement a été jugée sur la survie et la croissance tumorale.

Résultats. Le cisplatine associé à un milieu fortement hypotonique, le G2,5%, a montré les meilleurs résultats in vitro à la dose de 50 µmol/l, avec un taux de viabilité cellulaire à 48 heures de 35% versus 90% pour le cisplatine seul. L'hypotonie potentialise l'action du cisplatine en activant une voie de mort cellulaire différente de la voie classique, en activant la caspase 1. In vivo, le cisplatine associé au G2,5% en intra-tumoral a montré un ralentissement de la croissance tumorale. Au 15ème jour, la surface tumorale était multipliée par 0,8 après traitement par cisplatine associé au G2,5% versus 3,5 dans le groupe témoin. L'effet se prolongeait jusqu'au 25ème jour avec des taux de croissance tumorale respectivement de 1,8 et 6,8. Aucune souris n'est décédée à l'issue du traitement.

Conclusion. Le cisplatine semble être la chimiothérapie de choix pour l’injection intra-tumorale. L’hypotonie potentialise fortement ces effets. L’injection intra-tumorale de cisplatine hypotonique pourrait améliorer les résultats des résections incomplètes de cancers colorectaux.

Résumé
Introduction. La chirurgie mini-invasive de la base du crâne s’est développée avec l’endoscopie mais, afin de pallier ses inconvénients (image en 2D, impossibilité de suturer, problème d’étanchéité, etc.), nous proposons une technique innovante d’abord transoral de la base du crane assistée par le robot da Vinci.

Objectif. Nous avons cherché à décrire une nouvelle voie d’abord mini-invasive de la base du crâne, et tout spécialement de l’hypophyse, à l’aide du système robotique da Vinci utilisé en routine dans d’autres spécialités ; ce par un travail anatomique de dissection sur cadavres humains frais.

Méthodes. Dix sujets anatomiques ont été préparés pour cette étude, positionnés en décubitus dorsal, bouche ouverte. Le plan de la salle était le suivant. Deux chirurgiens étaient nécessaires. Le voile du palais était rétracté puis la muqueuse du cavum disséquée au robot. Ensuite le corps du sphénoide était fraisé par le chirurgien au lit du malade sous contrôle scopique afin d’accéder à l’hypophyse, qui était retirée à l’aide du robot. Les temps opératoires et les éventuelles difficultés d’exposition étaient rapportées.

Résultats. Nous avons atteints l’hypophyse (figure ci-dessous) dans la totalité des dissections, sans léser les tissus avoisinants, dans un temps raisonnable de 60 minutes. La qualité de vision en 3D et la maniabilité des instruments robotiques jusque dans la selle turcique ont démontré le potentiel de cette nouvelle voie d’abord, mini-invasive, qui préserve les cavités nasales.

Conclusion. Nous avons décrit une nouvelle technique inédite sur cadavres qui laisse entrevoir de nouvelles perspectives dans la chirurgie hypophysaire, de par son caractère non invasif et des possibilités visuelles et techniques (sutures) innovantes. Ce travail a fait l’objet d’une publication (Neurosurgical Review, may 2014).

Résumé
Introduction : La qualité d’un greffon pulmonaire humain peut être évalué ex vivo, avant implantation chez le receveur, par des critères hémodynamiques et respiratoires. Néanmoins, afin d’accroitre les connaissances dans le domaine de la perfusion pulmonaire, l’utilisation de modèles expérimentaux simples et peu couteux chez le petit animal est encouragée. Nous avons développé un modèle de perfusion pulmonaire de rat afin de comparer poumons sains et poumons lésés. Nous avons recherché les microparticules (MPs) – vésicules membranaires dérivées de cellules stimulées ou apoptotiques, mesurées comme biomarqueurs de lésion cellulaire – émises par nos poumons perfusés. Nous rapportons les résultats de l’évaluation hémodynamique et respiratoire de ce modèle et du dépistage de MPs broncho-alvéolaires et systémiques.

Matériels et Méthodes : Nous avons prélevé le bloc bi-pulmonaire de rats mâles Wistar adultes (300 à 450g). Ces rats étaient préalablement anesthésiés (pentobarbital intrapéritonéal ; 50mg/kg) et héparinés (100 UI/rat). Après prélèvement, les blocs bi-pulmonaires étaient placés dans une chambre pleurale, à 37°C. Les poumons sains (n=5) étaient reperfusés immédiatement tandis que les poumons lésés (n=6) étaient soumis à une ischémie chaude à 37°C pendant 1 heure avant d’être reperfusés. Notre solution de perfusion (Perfadex®, acellulaire, 37°C, pH=7,40) était injectée par une canule d’injection placée dans l’artère pulmonaire. Une canule de drainage avait son extrémité distale placée dans l’atrium gauche. Le débit et la durée de perfusion étaient respectivement de 7mL/min et de 60 minutes. L’affluent était désoxygéné et carboxylé par un mélange gazeux (95% N2, 5% CO2) pendant qu’une canule trachéale permettait la ventilation pulmonaire (TV=4mL/min, FR=70bpm, FiO2=21%). Les variables enregistrées étaient la pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPm), et la pression de pic des voies aériennes (PVAp). La PaO2 et la PaCO2 dans l’effluent du bloc bi-pulmonaire étaient mesurées 10, 30, et 60 minutes après reperfusion. Les poumons étaient ensuite pesés puis séchés pendant 60h à 21°C pour calculer le ratio poids mouillé/poids sec (M/S ratio). Les dépistages des MPs broncho-alveolaires, prélevées dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire, et des MPs systémiques, prélevées dans l’effluent, étaient réalisés par un test de prothrombinase aprés capture par un test à l’annexine 5.
Nous avons utilisé un test non paramétrique ( test de Wilcoxon) pour comparer les deux groupes.

Résultats : Il n’existait pas de différence significative de PAPm entre poumons sains et poumons lésés (p>0,05). Le M/S ratio des poumons sains et des poumons lésés était équivalent (p=0,4). Les PVAp des poumons lésés étaient augmentées après 50 minutes (p=0,01) et 60 minutes (p=0,01) de reperfusion. Concernant l’hématose, les PaO2 des poumons lésés étaient significativement plus basses durant toute la durée de perfusion (p<0,05) (tableau1). A l’inverse, les PaCO2 des poumons lésés étaient augmentées après reperfusion (p<0,05) (tableau 1). Des MPs broncho-alvéolaires et systémiques ont été mises en évidence.

Conclusion : Une ischémie chaude d’1 heure à 37°C permet d’obtenir un modèle de lésion pulmonaire dont les conséquences respiratoires reproduisent les situations de greffons pulmonaires marginaux et de dysfonction primaire de greffon pulmonaire. Le dépistage positif des MPs est le garant d’études quantitatives et qualitatives à venir. Nous pourrons alors étudier leur intérêt diagnostique, pronostique, et thérapeutique en transplantation pulmonaire.

Résumé
Le développement de stratégies personnalisées pour la prévention et la détection précoce des cancers, qui est le premier axe de recherche stratégique et innovant du plan cancer 2014-2019, pourrait permettre de diminuer la morbi-mortalité élevée des carcinomes épidermoïdes de la cavité orale en identifiant précocement les patients porteurs de lésions orales à haut risque de cancer. Notre objectif est de caractériser la dynamique des changements moléculaires au cours du temps dans les lésions à potentiel malin (LPM) de la cavité orale, afin d’identifier des évènements moléculaires clés dans leur processus de transformation maligne, qui pourraient être utiles dans la décision médico-chirurgicale comme biomarqueurs du risque de cancer plus performants que les seuls paramètres cliniques et histologiques.
Nous avons étudié la dynamique du transcriptome au cours du processus tumoral dans un modèle murin de carcinogénèse orale induit chimiquement par un agent carcinogène (4-NQO). Notre hypothèse est que les changements d’expression des gènes dans ce modèle nous permettront d’identifier les patients ayant une LPM associée à un risque élevé de cancer et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Au total, 52 souris ont été réparties en un groupe contrôle et un groupe traité par le 4-NQO administré dans leur boisson pendant 8 semaines. Toutes les 4 semaines, 4 souris étaient sacrifiées dans chaque groupe et leurs langues étaient excisées puis incisées longitudinalement. Chaque hémi-langue était ensuite incluse, congelée puis coupée au cryostat pour coloration. Les différents aspects épithéliaux de la tumorigenèse multi-étapes observés dans ce modèle (normal, hyperplasie, dysplasie et tumeur) étaient repérés en collaboration avec un anatomopathologiste (VetagroSup, Lyon) puis microdisséqués par système laser couplé à un microscope. Après extraction et amplification des ARNs, un triplica biologique pour chaque stade de transformation était analysé sur puce d’expression. Nous avons identifié une liste de ~1300 gènes différentiellement exprimés entre les échantillons murins tumoraux et normaux, que nous avons ensuite validés après sélection de leurs orthologues humains (~1000 gènes), dans 3 séries humaines indépendantes comparant des échantillons tumoraux et normaux de la cavité orale. Certains gènes comme S100A9 ou le récepteur tyrosine kinase MET sont des candidats intéressants comme biomarqueur de risque ou cible thérapeutique potentielle. L’analyse de la dynamique d’expression de ces gènes au cours de la transformation maligne a permis d’identifier 2 groupes principaux de gènes : le « early change gene set » (ECGS), incluant 318 (32%) gènes dont l’expression se modifiait très précocement dès le stade d’hyperplasie et le « progressive change gene set » (PCGS) incluant 520 (53%) gènes dont l’expression se modifiait plus progressivement au cours du processus tumoral. Seul le PCGS était significativement associé au risque de développer un cancer chez 86 patients suivis prospectivement au MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) pour une LPM, et pour lesquels nous disposions des données d’expression des biopsies de leur LPM. Ces résultats sont cohérents avec une étude que nous avons menée en parallèle dans la même cohorte de patients mais à un autre niveau d’altération moléculaire, et dans laquelle nous avons montré que la persistance des pertes d’hétérozygotie détectées sur des biopsies successives était plus significativement associée au risque de développer un cancer que leur seule détection à un temps donné.
Ces données, issues d’une collaboration internationale et multidisciplinaire, soulignent la pertinence du modèle murin utilisé et l’importance de l’étude de la dynamique des changements moléculaires au cours du temps plutôt qu’à un moment donné de l’évolution. Nous espérons pouvoir ainsi personnaliser la prise en charge médico-chirurgicale des patients à risque de cancer de la cavité orale.